Erasmus osasi hyvin kreikkaa ja latinaa. Sen ansiosta hän pystyi vertaamaan latinankielisiä raamatunkäännöksiä, kuten Vulgataa, Raamatun kreikkalaisten kirjoitusten (ns. Uuden testamentin) varhaisiin alkukielisiin käsikirjoituksiin. Hän vakuuttui siitä, että Raamatun tuntemus oli elintärkeää. Siksi hän oli vahvasti sitä mieltä, että Pyhä Raamattu tuli kääntää kielille, joita puhuttiin yleisesti tuohon aikaan.

Erasmus pyrki edistämään katolisen kirkon sisäistä uudistusta, sillä hän uskoi, että kristillisyyden tuli olla elämäntapa eikä pelkästään merkityksettömiin seremonioihin osallistumista. Niinpä kun reformaattorit eli uskonpuhdistajat alkoivat protestoida ja vaatia muutoksia Rooman kirkkoon, katolilaiset tulivat epäluuloisiksi Erasmusta kohtaan.

Satiirisissa kirjoituksissaan Erasmus paljasti pappien väärinkäytökset ja mahtailevan elämäntyylin sekä sotia ihannoivien paavien kunnianhimoisuuden. Hän ei hyväksynyt turmeltuneita kirkonmiehiä, jotka käyttivät kirkollisia tapoja – muun muassa ripittäytymistä, pyhimysten palvontaa, paastoa ja pyhiinvaellusmatkoja – uskovien riistämiseen. Hän myös paheksui sellaisia kirkon käytäntöjä kuin anekauppaa ja pakollista selibaattia.

Vuonna 1516 Erasmus julkaisi ensimmäisen versionsa Uudesta testamentista kreikaksi. Se oli ensimmäinen alkukielinen Raamatun kreikkalaisten kirjoitusten laitos, mitä on koskaan painettu. Tähän teokseen sisältyi myös selityksiä sekä Erasmuksen tekemä latinankielinen Uuden testamentin käännös, joka poikkesi Vulgatasta. Erasmus jatkoi teoksensa hiomista vielä pitkän aikaa, ja lopullinen laitos erosi latinankielisestä Vulgatasta vieläkin dramaattisemmin.

Yksi eroavuus oli 1. Johanneksen kirjeen 5:7:ssä. Epäraamatullisen kolminaisuusopin tueksi Vulgataan oli lisätty väärennetty tekstikatkelma, joka tunnetaan nimellä comma Johanneum. Katkelma kuuluu: ”Taivaassa: Isä, Sana ja Pyhä Henki, ja ne kolme yksi ovat.” Erasmus kuitenkin jätti nämä sanat pois kahdesta ensimmäisestä Uuden testamentin laitoksestaan, koska ne puuttuivat kaikista hänen käyttämistään kreikankielisistä käsikirjoituksista. Myöhemmin hän kirkon painostuksesta sisällytti nuo sanat kolmanteen laitokseensa.

Erasmuksen kreikankielisen Uuden testamentin parannellut laitokset loivat perustan laadukkaammille käännöksille, joita tehtiin eurooppalaisille kielille. Hänen tekstiensä avulla Martti Luther käänsi Uuden testamentin kreikasta saksaksi, William Tyndale englanniksi, Antonio Brucioli italiaksi ja Francisco de Enzinas espanjaksi.

Erasmus eli merkittävän uskonnollisen kuohunnan aikaa, ja hänen kreikankielinen Uusi testamenttinsa oli korvaamaton apuväline protestanttisille reformaattoreille. Jotkut pitivät Erasmusta itseään uskonpuhdistajana. Reformaation alkaessa toden teolla hän kuitenkin kieltäytyi asettumasta millekään puolelle suurissa teologisissa väittelyissä. Tutkija David Schaff kirjoittikin Erasmuksesta yli sata vuotta sitten: ”Hän kuoli eristäytyneenä, ulkona kaikista ryhmittymistä. Protestantit eivät saaneet häntä puolelleen, katolilaiset taas eivät halunneet.”