Excelentele lui cunoștințe de greacă și de latină i-au permis să compare diferite traduceri în latină ale Bibliei, precum Vulgata, cu unele dintre primele manuscrise grecești ale Scripturilor grecești creștine, cunoscute pe scară largă drept Noul Testament. El s-a convins că este esențial ca oamenii să aibă cunoștință biblică. De aceea, a afirmat că Sfintele Scripturi ar trebui să fie traduse în limbile vorbite pe atunci.

Erasmus a susținut necesitatea unei schimbări în sânul Bisericii Catolice, întrucât, în opinia lui, creștinismul trebuia să fie un mod de viață, nu o simplă participare la ritualuri lipsite de sens. Ca urmare, când reformatorii au început să protesteze și să ceară efectuarea unei schimbări în Biserica de la Roma, catolicii au început să aibă suspiciuni cu privire la Erasmus.

În lucrările sale, Erasmus a satirizat abuzurile clericilor, stilul lor de viață luxos și ambiția papilor care susțineau războaiele. I-a condamnat pe clericii corupți care se foloseau de obiceiuri bisericești, cum ar fi spovedania, venerarea sfinților, postul și pelerinajele, cu scopul de a-i exploata pe credincioși. De asemenea, a dezaprobat unele practici bisericești, precum vânzarea de indulgențe și impunerea celibatului.

În 1516, Erasmus a publicat prima sa versiune a Noului Testament în greacă, aceasta fiind prima ediție a Scripturilor grecești creștine publicată vreodată. Lucrarea lui Erasmus includea adnotări, precum și traducerea Scripturilor grecești creștine în latină, având unele diferențe de sens față de textul Vulgatei. El a continuat să-și revizuiască traducerea, textul final ajungând să fie și mai diferit de cel al Vulgatei.

Una dintre diferențe este cea din 1 Ioan 5:7. Pentru a susține învățătura nebiblică a Trinității, sau a Sfintei Treimi, în Vulgata au fost adăugate cuvintele apocrife cunoscute sub denumirea de comma Johanneum: „în cer: Tatăl, Cuvântul și Duhul Sfânt, și aceștia trei una sunt”. Totuși, Erasmus le-a exclus din primele sale două ediții ale Noului Testament deoarece niciunul dintre manuscrisele grecești pe care le-a consultat nu le conținea. Mai târziu, supus presiunilor din partea Bisericii, el le-a inclus în cea de-a treia ediție.

Edițiile îmbunătățite ale Noului Testament în greacă realizate de Erasmus au constituit o bază pentru producerea unor traduceri mai bune ale Bibliei în diferite limbi europene. Martin Luther, William Tyndale, Antonio Brucioli și Francisco Enzinas le-au folosit pentru a traduce Scripturile Grecești în germană, engleză, italiană și, respectiv, spaniolă.

Erasmus a trăit într-o perioadă de frământări religioase intense, iar Noul Testament în greacă realizat de el a constituit un ajutor deosebit de valoros pentru reformatorii protestanți. Erasmus a fost considerat de unii reformator. Însă când Reforma a început realmente să prindă contur, el a refuzat să participe la marile dezbateri teologice care au urmat. Demn de remarcat, cu peste 100 de ani în urmă, eruditul David Schaff a scris că Erasmus „a murit singur, fără vreo afiliere religioasă. Catolicii nu-l voiau, iar protestanții nu puteau susține că e de-al lor”.